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病毒性肝炎的基因治疗

更新时间:2001年12月27日00:00:00    作者:战胜乙肝网    文章来源:
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  解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心(100039)

  引起病毒性肝炎的病原体主要是肝炎病毒,包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV),近年来的研究表明,GB病毒(GBV)/庚型肝炎病毒(HGV)和输血传播病毒(TTV)。最近报导国外发现了SEN病毒(SENV),可能是解释目前仍有10~15%的病毒性肝炎患者病原学不清的问题。无论是那一种肝炎病毒感染引起的急性、慢性病毒性肝炎,根本原因是病毒复制和表达的存在,病毒的抗原诱发机体的免疫原理反应,造成肝脏炎症损害。因此,要从根本上解决病毒性肝炎的问题,从基因水平上,寻求阻断、抑制、甚至是清除肝炎病毒,是非常重要的思路。基因治疗是生物医学领域中研究的一个热点。

  一、 基因治疗的概念和策略

  基因治疗就是用正常或野生型基因校正或转换缺陷或致病基因的一种分子生物学水平的治疗方法。传统意义上的基因治疗(gene therapy),是指目的基因导入靶细胞以后与宿主细胞内的基因发生整合,成为宿营主细胞遗传物质的一部分,目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。近些年来,采用某些基因转移技术,即使目的的基因和宿营主细胞的基因不发生整合,目的基因也可得到暂时表达。目的基因的表达产物也具有一定的治疗作用。这种基因治疗中应用的目的基因应象我们平常在临床上使用的药物一样。为了与传统意义上的基因治疗相区别,这种目的基因不与宿主细胞基因组发生整合,暂时表达产物发挥治疗作用的基因治疗方法叫做基因疗法(gene therapeutics)。

  基因治疗中根据针对宿主病变细胞基因采取的措施不同,又分为基因转换(gene replacement),基因修正(gene correction),基因修饰(gene augmentation),基因灭活(gene inactivation)和基因疫苗(gene vaccine)等五大策略。基因灭活和基因疫苗是阻断和抑制肝炎病毒基因复制和表达的重要基因治疗手段。基因治疗的条件包括:目的基因的获得,靶细胞的选择以将目的基因导入窠主细胞基因转移的高效手段。基因治疗的步骤包括:目的基因的准备、受体细胞的培养、载体的选择、将目的基因导入到靶细胞等。

  二、 病毒性肝炎的基因治疗

  基因治疗在抗肿瘤,遗传性疾病和传染病的治疗中有十分重要的应用前景,近年来的研究表明,基因治疗在病毒性肝炎的治疗中也能发挥重要的影响。病毒性肝炎的基因治疗研究虽然取得了一系列的进展,但是,由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚,目前基因治疗在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态,另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。

  (一) 淋巴因子转基因表达

  淋巴因子在传染病治疗中具有十分重要的作用和广泛的应用前景。其中的干扰素(IFN)已成为目前抗肝炎病毒治疗唯一公认有效的基因工程药物。利用淋巴基因表达进行传染病的基因治疗研究,是基因治疗在传染病中的一个重要应用和重要的研究方向。

  1、 干扰素的基因转移与表达

  Seif等将小鼠的干扰素β(IFNβ)的基因置于主要组织相容性复合体(MHC)的启动子序列的控制之下,构建重组表达载体,转染Babl/c小鼠的成纤维细胞系NIH3T3,得到了持续的IFNβ的表达。表达IFNβ的细胞系,对滤泡口炎病毒(VSV,vesicular stomatitis virus),脑心肌炎病毒(EMCV,encephalomy-ocarditis virus)和塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)的复制和表达均有明显的抑制作用。并发现持续低水平的IFNβ的分泌表达,就可以使这一细胞系产生明显的抗病毒状态。然而,用等量的外源重组的IFNβ则无此效果。而且,加入相应的IFNβ的单克隆抗体并不能阻断这种转导的细胞系对上述三种病毒的抑制效应。因此认为,此细胞系的抗病毒状态的产生,除了和分泌型IFNβ的表达有关以外,还有可能存在其它的作用方式。另外,Bednarik等将人的α2干扰素(IFNα2)的基因重组到人免疫缺陷病毒(HIV)的长未端重复序列(LTR)中的启动子下游,转入非洲绿肾细胞系中,IFNα2的分泌表达水平持续在50~150u/ml之间。这一低水平的IFNα2的表达完全可以抑制HIV的复制和转录。同样地也发现就用相应水平的外源重组的IFNα2也无此效果。而且IFNα2的单抗也不能阻断IFNα2的抗病毒作用。这一差别的原因,作者认为体内产生的IFNα2与体外重组的IFNα2的抗病毒机理不同。外源重组的IFNα2的抗病毒机理,是抑制HIV的成熟和装配过程,而内源表达的IFNα2的抗病毒作用,似乎是主要作用在转录水平以及HIV mRNA的稳定性等方面。

  2、 白细胞介素-2的转基因表达

  Guidotti等应用HBV DNA转基因小鼠,证实IL-2对HBV DNA转录的2.1kb的mRNA具有明显的抑制作用。认为IL-2对HBV DNA转录2.1kb mRNA的启动子活性有明显的负调控作用。同时,还通过肿瘤坏死因子(TNF)和γ干扰素(IFNγ)的诱生达到抗病毒的效果。因为肝细胞膜上没有IL-2的受体,所以认为IL-2的抗病毒作用是其对HBV DNA启动子活性的直接抑制使用来实现的。并且认为IL-2抑制HBV DNA的表达是在转录后水平上发生的。

  (二) 寡腺苷酸合成酶转基因表达

  Chebath 等构建了2'-5'AS的真核表达载体,和作为标志基因的二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的表达载体以共转染的方式,导入到中国仓鼠卵母细胞(CHO)中,得到了2'-5'AS的表达。这一转导的细胞系和其亲本细胞相比较,具有显著的抗小RNA病毒的能力,如门果病毒(mengovirus)等的感染。这一研究结果表明,表达2'-5' AS的细胞系可以绕过IFN的诱生,仅仅靠2'-5' AS的表达也能产生显著的抗病毒效应。这种2'-5' AS诱生在IFN抗病毒治疗中是有普遍意义的。因此,这是一个很有价值的探索方向。

  (三) 病毒抗原编码基因的转基因表达

  Felgner等首先将HIV的糖蛋白gp120的基因与巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IF,immediate early)启动子序列重组,构建了表达gp120的重组表达载体。将这种重组表达载体的质凿DNA进行肌肉注射,一部分细胞可获得这种DNA而进行表达gp120。作为一种抗原,机体可以产生免疫保护性抗体。这种特异性的免疫应答是防治HIV的重要途径之一。Morin等也得到类似的结果。

  (四) 保护性抗体的基因导入与表达

  HIV感染CD4+细胞并使其破坏,造成CD4+细胞的数量减少,甚至完全丧失。以至于与之相关的免疫功能缺陷。保护CD4+细胞不受感染,其中的一种策略就是利用基因治疗技术导入HIV-1抗体的基因进行表达,中和HIV的感染性,Marasco等导入了针对HIV-1的单链抗体基因,可以特异性地与HIV-1的包膜糖蛋白相结合,以抑制或阻断HIV的感染能力。以HIV的cDNA的单链抗体的编码基因共转染T淋巴细胞中,其中HIV表达其核心蛋白(gag)的水平变化不大,但产生具有感染能力的HIV病毒颗粒的数量却显著降低。最近,Pomerantz等研究资料表明,抗Rev的单链抗体的表达,在细胞浆中可以捕获Rev蛋白,并且可以抑制HIV的表达。提示以HIV抗体的编码基因作为目的基因进行抗病毒基因治疗,是一个有希望的途径。但是,HIV可以编码多种结构和调节蛋白,作为抗原可以引发机体产生不同的抗体,为了优化细胞内抗体的表达,抗HIV感染的基因治疗的策略,必须对各种可能的抗体抑制或阻断HIV感染的效果进行比较,以获得较为理想的基因治疗效果。

  (五) 阻断病毒进入细胞的过程

  HIV感染并进入宿主细胞,必需借助其包膜糖蛋白pg120与宿主淋巴细胞膜上的CD4抗原相结合,这也是HIV选择下破坏CD4+细胞的重要原因。因此以过量的CD4抗原分子和HIV的包膜糖蛋白gp120,就可以阻断和抑制HIV的感染能力。由此保护未受感染的CD4+细胞。只要保证CD4+细胞的合适数量,HIV感染者就不会发展成严重的免疫缺陷,招致严重的机会性感染。Fischer等均可溶性CD4+(sCD4)分子的编码基因导入到体外培养的T淋巴细胞中,sCD4分子确实可以阻断HIV-1的感染。免疫系统中CD4分子的正常功能与主要组织相容性复合体(MHC Ⅱ)型分子的免疫识别密切相关。因此,应用这种sCD4分子干扰HIV-1与CD4+细胞结合来进行抗病毒基因治疗,担心会干扰MHC Ⅱ特异性T细胞的功能。转基因小鼠的研究结果表明,这种担心实际上是没有根据的。Weber等建立了表达sCD4分子的转基因小鼠品系,持续表达sCD4分子达100ug/ml,但如此高水平的sCD4分子的表达,并没有影响小鼠CD4+细胞对同各异型抗原或抗-CD3抗体刺激的免疫识别和免疫应答。

  另外,辅助性T细胞介导的体内抗体的应答机制,也不受sCD4分子过表达的影响。Morgan等曾应用逆转录病毒表达载体-包装细胞系基因转移系统,将sCD4的编码基因导入到人T淋巴细胞中进行表达,可以明显抑制HIV-1的感染。最近,sCD4与免疫球蛋白融合基因的表达,也获得了明显的抗HIV-1的效果。但是,以sCD4基因作为目的的基因的抗HIV-1基因治疗I期临床实验却未取得预期的成功。从临床标本中分离到了抗sCD4分子的抗性HIV-1病毒株,从一个侧面解释了其中的一个原因。实验证实,中和sCD4抗性株所需要的sCD分子数是sCD4敏感株的200-2700倍。因此,考虑到利用sCD4编码基因作为目的基因进行抗病毒基因治疗时,必须考虑到基因转移与表达调控的技术之外,还要考虑到sCD4分子本身的一些性质和特点。

  近年来,有关HIV-1感染的发病机制研究领域中最为令人兴奋的发现之一就是HIV-1感染,必须借助辅助分子(cofactor)融合素(fusin),即CC CKR5这种趋化因子受体的参与。因为HIV-1不仅可以高效地感染CD4-细胞系,如中枢神经系统的感染等,而且,将CD4分子的编码基因转染CD4-的细胞系,使其表型由CD4-变为CD4+,也不能导致其对HIV-1感染的敏感性增加。最后也想到了辅助分子的可能性。为此,各国科学家为之奋斗了整整8个春秋,才从众多的候选分子中确认融合素是HIV感染宿主细胞的必须结合的辅助分子。这一重要发现,必须会导致抗HIV感染新疗法的出现。针对融合素分子抗体的基因治疗以及融合素基因特异性的核酶(ribozyme)的分子设计,将是抑制或阻断HIV感染靶细胞的基因治疗手段。

  关于HBV的受体一直认为PHSA-R是HBV感染靶细胞的受体分子,但这种观点也存在严重的不足。最近的研究结果表明,附加素V(annexin)可能是HBV感染靶细胞的另一个受体分子。关于HCV受体的研究,发现CD81这种跨膜分子,可能是HCV感染靶细胞的受体分子。根据肝炎病毒的受体分子的性质,可能是探索抗肝炎病毒治疗方法的重要思路,但目前还没有实质性进展。

  (六)、细胞内免疫

  Malim等根据HIV-1的反式激活Rev蛋白的结构特点,设计了抗HIV-1基因治疗的细胞内免疫策略。Rev蛋白富含亮氨酸的羧基未端是其反式作用的绝对依赖区。此区的突变体作为野生型Rev蛋白的竞争性抑制因子,对未剪切的单剪切的HIV RNA的表达的稳定性都有显著的影响。将HIV Rev氨基酸序列中78位(L-D)和79位(E-L)进行定点诱变,则形成突变体Rev M10。此突变体保持了野生型Rev与Rev应答元件(RRE)结合的能力,却没有任何激活功能。以逆转录病毒载体-包装细胞系基因转移系统,将编码Rev M10的基因导入到人T细胞系中以后,稳定表达Rev M10的转染细胞系可以显著抵抗HIV-1的感染,并在人的外周血T淋巴细胞中得到重复。另外,将病毒基因特异性核酶的编码基因导入到T细胞之中,也能使转导的细胞产生针对这种病毒的细胞内免疫状态。利用噬菌体展示技术筛选得到的肝炎病毒特异性单链可变区抗体可能是进行抗肝炎病毒细胞内免疫基因治疗的重要研究方向。

  (七)、诱饵设计

  病毒基因的分子生物学研究为抗病毒基因治疗提供了新的设计思路。如人免疫缺陷病毒(HIV)基因调控存在着极为复杂的顺式和反工调节机制,这些调节机制已成为设计抗病毒基因治疗方案的重要依据。HIV反式调节(trans regulation),即某些反式激活剂(transactivator)与HIV RNA的相应靶位结合,与HIV基因组复制和表达有着极为密切的关系。因此,可以设计一种基因,其转录物与HIV RNA竞争性地反式激话相结合,HIV RNA没有足够的反式激话剂的结合与刺激,就不能进行有效的复制和表达。与HIV RNA竞争性与反式激活剂引结合的RNA片段,称为诱饵(decoy)分子。

  诱饵RNA分子表达载体的设计和基因治疗是抑制HIV复制和表达的重要策略。诱饵方案的设计和应用寻求病毒核酸与反式激活剂的分离,这就要求诱饵分子要处于量的优势。即必须处于"过表达(overexpression)"状态。只有如此,才能有足够的诱饵分子与HIV RNA竞争性地结合反式激活剂。针对HIV来说,诱饵设计最为常用的基因片段为Tat和Rev等。Gilboa等将HIV-1的Tat和Rev 的两断基因分别插入逆转录病毒载体,在内源性polⅢ(tRNAmet)启动子系列的控制之下进行表达,可抑制CEM细胞中HIV的复制和表达。为了提高诱饵的表达水平及抗病毒作用,可将多个诱饵的编码基因头尾串联在一起,这样可提高表达的诱饵的分子数,提高其抗病毒的作用。

  病毒基因的反式调节机制,不仅是设计抗病毒基因治疗直接的理论根据,而且还为提高目的基因的表达水平提供了有效的手段。Bednarick等将人的IFN基因重组在HIV-1 LTR中的启动子系列的下游,转入Vero细胞以后,其分泌IFN的水平仅在50~150u/ml之间。如果向此表达系统中提供LTR中的启动子的反试激活剂tst蛋白,受到反式激活以后,可使IFN的表达水平提高到103u/ml。目前基因治疗研究领域中,基因的表达水平不高,妨碍了基因治疗技术发挥更好的作用,这一机制是很有意义的。不仅细胞因子的表达水平可应用这一策略进行提高,诱饵分子的表达水平也同样可以利用这一反式激活机制而得到提高。

  (八)病毒感染细胞的自杀机制

  抗病毒基因治疗的研究,大多数情况下是根据病毒的分子生物学特点,依照细胞内免疫的原则进行设计的。这些方案的设计在很大的程度上依赖于包括蛋白质和RNA在内的感染因素的持续高水平的表达,这也是为什么细胞内免疫难以取得彻底治疗效果的一个重要原因。因此,可以设计清除病毒感染细胞的基因治疗方案,而不是单纯干扰病毒的复制和表达过程。其中,自杀基因的导入及病毒感染细胞的清除的基因治疗的策略在这一领域中占有重要地位。

  引起细胞自杀的所谓"自杀基因(suicide gene)"种类很多,如某些病毒的基因,已知白喉毒素(DTA)在极低水平的情况下即可引起细胞发生死亡,促进药物代谢和转换的基因,如水痘-带状疱疹病毒(VSV)胸腺嘧啶核苷激酶(TK),可使无毒的丙氧鸟苷(GAN,ganciclovir)转换为毒性极强的代谢产物,杀死细胞,HSV的TK基因也有类似的效果。另外还包括引起细胞程序化死亡(PCD,programmmed cell death)的基因等。

  上述自杀基因的导入,可以有效地杀伤转导的细胞是无疑的,但怎们保证细胞自杀的范围仅限于病毒感染的细胞,而对于正常细胞没有副作用是设计是其关键。这种基因治疗的方案也同样可以利用病毒感染细胞的特点进行设计。法国的Klatzman等根据HIV及其感染细胞的特点设计了HIV感染细胞的自杀机制,以清除病毒感染的细胞,取得取较为满意的治疗效果。首先,将DTA基因重组到缺失突变型HIV LTR启动子的下游,`如果细胞加没有HIV的感染并提供反式激活蛋白,这种DTA就不会表达;但如果细胞感染了HIV,HIV的复制和表达过程同时为DTA的表达提供了的反式激活剂,经刺激表达以后,可以引起HIV感染细胞的死亡。没有感染HIV的细胞存在反式激活蛋白,DTA不表达,可以完好存活下来。利用这种机制就能选择性地清除病毒感染的细胞。因此自杀机制也是抗毒基因的治疗的一个重要组成部分。

  (九)反义核苷酸

  反义核苷酸包括反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN,oigodeoxynucleotide)和反义RNA两种。反义RNA是在研究原核细胞基因调控中发现的一种负性调节因素。但后来证明,真核细胞的基因调控中也有反义RNA的参与。认为反义RNA分子在基因表达的调控中具有普遍 的意义。反义RNA与其序列互补的靶RNA以碱基酸对方式结合。阻断基细胞内的转运,剪切加工,与核糖体的结合。而且激活内源性的核核酶(如RNaseH等)将其分解。以抑制或阻断某一基因的表达和功能。这一基因表达调控的机制,很快也应用了抗病毒基因治疗的研究中。

  Chatterjee 等应用腺相关病毒(AAV)载体构建了HIV RNA的反义RNA的表达载体,将这种重组表达载体导入到T淋巴细胞中,表达的反义RNA可与HIV LTR TARA 的一段63bp的序列补。这种反义RNA的表达,对HIV-1的抑制率达70-90%。反义RNA不仅在控制HIV-1感染中具有重要作用,而且在控制HBV,HSV人乳头瘤病毒(HPV),劳氏肉瘤毒(RSV)等的感染中都有重要应用。

  (十)核酶

  核酸(ribozyme)是一种具有酶的催化作用,能够在GUC等特定的核苷酸序列的下游切割RNA分子的一类小RNA分子。核酸RNA分子的发现,打破了蛋白质在酶学领域中一统天下的局面,将酶的概念从蛋白质扩展到核酸领域。核酸RNA分子与底物RNA分子碱基酸对的方式进行结合,保证了核酶作用的高度特异性。同时,核核酸与底物结合形成的酶学活性中心,可对底物进行切割,破坏其结构。这样,经切割的RNA链再也不能作为翻译蛋白质的模板,也不能作为逆转录的模板进行核酸的复制。核酶裂解物RNA高度特异性,高效裂解RNA底物的性质,作为抗病毒基因治疗的新型分子,受到了广泛的重视。认为核酸技术是抗病毒基因治疗方案设计中重要探索方向。 核酸首先是在植物类病毒,卫星病毒及某些原虫,如四膜虫(tetrahynena)等的研究中发现。总结这些核酸RNA分子的基本结构,大致有锤头状(hannerhead motif)。发夹状(hairpin motif)以及斧头状(axed motif)等结构类型。根据这些核酸基本结构类型,设计相对保守的活性中心结构,根据底物RNA链中裂解位点及其附件的核苷酸序列结构,设计核酶的侧翼序列(flanking sequence)。从理论上来讲,只要了解底物RNA 的系列及结构性质,就能设计出针对任何RNA分子的特异性核酶。核酶RNA分子中的侧翼序列长谑只要保证在17nt以上,设计的核酶与底物RNA 分子结合的特异性,就会对人体细胞中正常的RNA发生列解反应。因为即使有一个核苷酸不能正确配对,活性中心就不能形成,列解反应就不会发生。

  核酸的本质是RNA,从自然界中提取纯化针对特异基历片段的核酶RNA 分子是根本行不通的。人工RNA的合成是一条途径,但价格昂贵。没有实用前途。基因RNA制药又没有突破性的进展。因此,核酶的实际应用还需走基因治疗的途径。即体外设计核酶的编码基因,以逆转录病毒载体导入到靶细胞中进行表达。这种基因治疗的策略已经过较为周密的细胞及动物水平的系统研究,美国已于1994年夏天开始抗HIV基因治疗的I期临床实验。

  1990年,Sarver等首次构建了HIV特异性核酶的重组表达载体,并在细胞内,细胞外成功地对HIV RNA进行了切割,以及抗HIV基因治疗的实验研究。抗HBV的核酶基因治疗也顺利进行。1992年,Chen等设计了9靶位的抗HIV核酶及Weizsacker等设计了3靶位抗HBV的核酶,使核酶的抗病毒技术日致成熟,成为抗病毒基因治疗中又一重要的研究方向。想信核酶抗病毒基因治疗途径在未来的抗病毒基因治疗研究中发挥更大的作用。

  三、 病毒性肝炎的基因疫苗

  将重组表达载体直接导入在体的器官和组织中,并获得目的基因的表达,这在10余年之前就已实现,并作为某些基因治疗方案中外源基因导入体内的一种方式而受到了广泛的重视。但利用这一技术将一种诱导保护性免疫应答的抗原蛋白的重组表达载体导入体内,作为预防和治疗传染病的一种技术,不过是近几年的事情。Ulmer等首先以流感病毒(influenza) 核壳蛋白(NP)的重组表达载体DNA接种健康小鼠,取得有效的体液与细胞免疫应答,并可以保护免疫动物不受多种流感病毒的感染攻击,从而开创了基因疫苗防治传染病的新时代。

  (一) 基因疫苗的发展

  流感病毒基因疫苗的研究开创了基因疫苗预防与治疗传染性疾病的新时代。流感病毒基因疫苗首先采用了高度保守的流感病毒核壳蛋白编码基因,获得了不同株流感病毒的交叉免疫保护作用。特别是后者又具有更为重要的实际应用价值。因为诸如人免疫缺陷病毒(HIV),丙型肝炎病毒(HCV)等病毒基因组存在着不同的基因型,而且在机体免疫选择的压力下还在继续发生突变,如HCV的准种性就是一个典型的例子。对于流感病毒这种抗原多变性病毒基因疫苗研制的成功,其意义是广泛而深刻的。

  自1993年以流感病毒基因组构建基因疫苗表达载体而获得成功以后,在短短在2年中,基因疫苗技术得到了迅猛的发展,不但从流感病毒扩展到HIV,HCV,乙型肝炎病毒(HBV)等病毒感染领域,还扩展到细菌,寄生虫,支原体等其它的传染病领域。不仅如此,抗肿瘤,自身免疫性疾病的基因疫苗研究也进展迅速。到1995年,抗肿瘤,抗HIV的基因疫苗在完成实验室和动物模型研究并取得良好的结果的基础上,已开始I期临床试验。这在一种生物学治疗方法,从概念与技术路线的提出,到临床I期试验,是时间最短的一次。现代生物学高技术发展速度之快,由此可见一斑。

  (二) 传染病基因疫苗研究概况

  关于传染病基因疫苗的研究,一方面寻找保护易感人群的有效免疫方法,同时基因疫苗又为难治性传染病的治疗提供了新的机遇。

  1、 病毒感染性疾病的基因疫苗

  HBV的基因疫苗研究,采用了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)的基因分别构建表达载体,或构建两种蛋白的融合基因,都能诱导免疫接种小鼠出现特异性的体液和细胞免疫应答。HCV基因疫苗的研究主要集中在核壳蛋白以及非结构蛋白3(NS3)等编码基因区,但也有少数研究采用了包膜区E1和E2区进行基因免疫。HIV基因疫苗则主要集中在HIV包膜糖蛋白的编码基因区,如gp160,gp120和gp41等的编码基因区。目前将HIV各种蛋白成份进行组装,成为不含核酸成份的非感染性病毒蛋白颗粒,其免疫效果较单一的病毒蛋白成份要好得多。流感病毒基因疫苗除了采用抗原性多变的血凝素抗原(HA)编码基因以外,还昆采用了高度保守的核衣壳蛋白(NP)的编码基因,从而避开了流感病毒抗原漂变,不易制备具有普遍意义的预防疫苗的难点。另外,对于狂犬病毒(Rabies virus),单纯疱疹病毒(HSV),人乳头瘤病毒(HPV),淋巴细胞脉络丛病毒(LMCV)的基因疫苗研究也取得了显著的进展。

  2、 细菌感染性传染病的基因疫苗

  针对细胞感染而设计的基因疫苗也取得了显著的进展。结核杆菌感染目前在全球范围内又呈上升的趋势。卡介苗的接种其免疫效果也值得进一步研究,而且在很多国家没有普遍进行卡介苗的预防接种。根据结核杆菌免疫的一些特点,设计了结核杆菌65kDa的热休克蛋白(HSP65)的基因疫苗,可以诱导特异性的体液与细胞免疫应答,对于随后接种的结核杆菌的感染具有显著的抵抗能力。以HSP65基因疫苗免疫所诱导的免疫保护作用与接种活的卡介苗的免疫保护作用效果相似,但以HSP65蛋白作为亚单位疫苗进行免疫接种则无此免疫保护效果。同时,以来源于结核杆菌36kDa的富含脯氨酸的蛋白的编码基因进行基因免疫,也能取得对结核杆菌感染的免疫保护作用。Huygen等应用结核杆菌抗原85(Ag85)的编码基因进行基因免疫,也获得了良好的免疫效果。

  (三) 病毒性肝炎基因疫苗研究的展望

  传染病基因疫苗的研究,首先要从传染病病原体的分子生物学研究做起。到目前为止,为数不少的传染病的病原体的基因结构及其编码产物的性质还没有弄清楚,这是妨碍传染病基因疫苗研究的一个瓶颈。只有解决好这个前提,才能选择好基因疫苗的目的的基因。

  传染病基因疫苗的研究,还要研究各种病原体抗原成份免疫应答的机制。许多研究已证明,并不是所有病原体的基因片段构建成的基因疫苗都能够诱导保护性的免疫应答,而且每一种基因疫苗的免疫应答能力也是千差万别的。基因疫苗能够诱导以细胞免疫为主的保护性免疫免疫应答是其区别于灭活疫苗与亚单位疫苗的重要标志,也是普遍认为基因疫苗为难治性传染病治疗方法最有前景的基本依据。但基因疫苗及其免疫应答的机制的研究还不系统。

  传染病基因疫苗的研究,其生命力还在于新型基因疫苗的研制。如慢性乙肝病人血清中有高滴度的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),但机体多已发展为对HBsAg的免疫耐受。尽管研究表明基因免疫因其抗原的加工与提呈的路径不同,从而产生与蛋白抗原不同的免疫效果,但以HBsAg的基因疫苗进行免疫接种时能否有效治疗慢性乙型肝炎还不一定。因为目前的研究大部分集中在正常动物的免疫应答上,但慢性乙肝病菌对HBsAg的应答已经发生了根本的变化,不能仅仅根据正常动物的免疫应答情况,推测慢性病毒感染个体的免疫应答。抗独特型基因疫苗恐怕是解决这一问题的有效途径。设计单一T细胞表位的基因疫苗也是较好的选择之一。在某些情况下设计针对不合适的原位点的免疫应答,反而促进病原体免疫逃逸株的形成或加重感染的程度。因此,采用针对单一T细胞位点的基因疫苗免疫策略更为有利。基因疫苗的研究还不得不重视抗原加工和抗原提呈方面辅助因子的功能。在某些情况下,可能是因为缺乏强免疫原的刺激,但也可能是因为抗原加工和提呈的辅助信号出现障碍,最终不能诱导有效的免疫应答。此时仅考虑病原体的抗原性是远远不够的,免疫应答的辅助刺激信号也具有同等重要的地位。随着这些技术环节的进一步解决,相信基因疫苗将是率先用于临床传染病治疗的一种基因治疗手段。

  

   

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责任编辑:战胜乙肝网

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