蔡晧东 马秀云（北京地坛医院，北京 100011）
拉米夫定作为一种新的抗HBV药物，其疗效已得到肯定。但由于拉米夫定是通过抑制HBV的复制而发生抗病毒作用，即它只能降低血清病毒载量，而不能完全清除病毒，因此需较长的疗程。随着拉米夫定在临床上的广泛应用，长期应用拉米夫定引起的HBV变异已成为一个越来越突出的问题。
一．拉米夫定相关性HBV变异：
HBV DNA聚合酶包含4个小的高度保守的结构域，分别为A、B、C、D区。YMDD基序是指酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸基序，位于HBV的C区，是DNA聚合酶的活性部位。拉米夫定结合于此区，干扰HBV的复制。长期应用拉米夫定治疗可导致YMDD基序中的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)替换，后者常伴有第528位亮氨酸(L)被M替换，也可伴有其他逆转录酶编码区或HBV基因组其他位点的变异，变异发生后导致病毒对拉米夫定出现耐药性。
Tipples等报道1例40岁白种女性患者因HBV感染后失代偿性肝硬化，在接受肝移植前用拉米夫定治疗。手术后16周，HBV DNA转为阴性，但在28周再次出现阳性，33周时达466pg/ml。基因测序显示第1656位核苷由G变为T，导致YMDD基序发生YIDD变异。在第一次治疗变异株出现后停药一段时间，野毒株又恢复成为优势株。Buti 等报告1例患者在拉米夫定治疗52周时出现耐药性变异，停药2周后检测其耐药株消失。这对再次应用拉米夫定治疗有一定的意义。但再进行第二次治疗时，变异株可很快再次出现。Marzano等在用拉米夫定治疗1例肝移植后复发性乙型肝炎患者时发现，在第一次出现YMDD变异后，停用拉米夫定一段时间后再次应用仍然有效，但很快出现再次耐药。
Chayama等报道20例慢性乙型肝炎患者给予拉米夫定100mg/d治疗，其中5例在治疗9～14个月时，HBV DNA再度升高。检测全部患者聚合酶序列发现：只有这5例DNA升高的患者出现变异。其中4例P区第741位鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代(G→T)，编码的蛋氨酸被异亮氨酸取代(M→I)，另1例患者第739位腺嘌呤被鸟嘌呤取代(A→G)，编码的蛋氨酸变为缬氨酸(M→V)。Tassopoulos等应用拉米夫定治疗HBeAg(-)/HBV DNA(+)的前C区变异株感染的慢性乙型肝炎患者时发现，41例患者在治疗第26周和52周时YMDD基序的变异率分别为2%和27%，在52周的11例YMDD变异者中有6例为野毒株与变异株共存，其余5例为完全变异株。说明随着治疗时间的延长，变异株出现增多。因此，如何防治拉米夫定相关性变异是目前应用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中急待解决的难题。
二．拉米夫定相关性变异对乙型肝炎治疗的影响：
1．HBV对拉米夫定的敏感性降低。Bartholomew等对1例用拉米夫定治疗的患者进行体外实验拉米夫定敏感性实验时发现，在治疗前拉米夫定0.03μmol/L即可抑制HBV DNA达94%，而发生耐药后要用30μmol/L才可抑制HBV DNA的80%。因此临床表现为服药后已阴转的HBV DNA水平再次上升。Allen等的拉米夫定耐药性HBV的体外试验表明，拉米夫定诱导的HBV YMDD变异株比HBV的野毒株对药物的敏感性下降为万分之一以下。Ladner等在对拉米夫定长期治疗的肝移植患者在过程中发生YMDD变异型HBV进行了研究。发现变异株对拉米夫定的敏感性比野毒株减少330倍，同时其DNA的复制率减少7倍。
2．YMDD变异株与野毒株相比，病毒复制率较低。Melegari等将野毒株及诱变产生的变异株与质粒结合后转染入HCC细胞及人胚肾细胞，对细胞分泌的HBV DNA、HBeAg及HBsAg进行检测，发现变异株与野毒株相比，病毒复制率较低。Seigneres等也曾报告与拉米夫定耐药相关性鸭HBV多聚酶变异株在体内外的复制能力减低。Chayama等(1998年)的研究证实，HBV的YMDD变异株的复制能力低于野毒株，因此临床上表现为在变异后多数患者肝病仅轻度加重，继续服药，仍有部分病人有效。这可能与变异株复制率低于野毒株有关，还可能因其中一部分病人为野毒株与变异株的混合感染，拉米夫定对其中的野毒株仍有抑制作用有关。
3．发生拉米夫定相关性HBV变异后患者可能出现ALT的升高。我院的研究结果可以看出发生YMDD变异后部分患者的ALT水平升高。治疗2年，后完全变异组、混合变异组和未变异组患者的平均ALT分别为56.3U/L、49.1U/L和26.0U/L。Perrillo等也发现肝移植后出现拉米夫定相关性YMDD变异的部分病人的肝脏组织学炎症改变恶化。
4．使用拉米夫定治疗的肝移植患者在发生拉米夫定相关性变异后，可能出现移植肝的再感染而很快发生肝衰竭。Mutimer等报道4例肝移植患者，发生拉米夫定耐药后血清中检测出高滴度的HBV变异株，并很快发生肝衰竭。其中3例患者停用免疫抑制剂治疗或间断使用抗病毒药物治疗后疾病得到控制。另1例患者加用泛昔洛韦治疗后好转。
多数学者报告，发生变异后尽管HBV DNA和血清ALT水平有升高趋势，但仍低于治疗前的水平，肝脏组织学多无改变。一些变异的患者，继续使用拉米夫定，还可能达到e抗原血清转换。但Liaw等的研究显示，变异发生后93.7%(30/32)的患者血清ALT升高；40.6%(13/32)的患者在变异发生后的4-94周(中位数，24周)发生肝病的急性加重。与没有发生急性加重的患者比较，急性加重的患者在YMDD变异发生之后血清HBV DNA水平明显增高。在出现肝病急性加重的临床表现之前，血清HBV DNA水平上升到峰值，接着是1-4周后ALT的峰值，并出现临床症状。9.4%(3/32)的患者发展为失代偿性肝病。有趣的是，发生失代偿性肝病的3例患者最终发生e抗原的血清转换，肝病恢复。值得警惕的是，个别患者在发生拉米夫定耐药性变异后发展成为重型肝炎。Peters等报道1例HBV感染的肾移植患者，在肾移植后6个月乙型肝炎复发。用拉米夫定治疗，肝功能好转。但随即因拉米夫定耐药引起暴发性肝衰竭，临床上表现为黄疸、全身水肿、腹水、肝性脑病、凝血障碍和肝-肾综合征，肝穿活检示肝组织呈亚大块坏死。Kim等报告韩国的1例59岁免疫功能正常的男性患者，服用拉米夫定150mg/d治疗，20个月后发生HBV的YMDD基序变异，肝病急性加重，并进展为亚大块肝坏死，最终病人死亡。
三．影响变异株出现的可能因素：
我院的研究表明，拉米夫定相关性HBV变异与患者的年龄、性别、发现HBV感染的时间和有无HBV感染的家族史均无相关性。说明年龄、性别、感染时间及感染方式不影响拉米夫定相关性耐药的出现。根据目前的研究认为，影响变异株出现的可能因素有以下几点。
1．治疗前的血清病毒载量对HBV变异的影响。我院的研究表明治疗前HBV DNA水平较高的患者易发生YMDD变异，且临床疗效较差。
2．前C区变异对HBV变异的影响。对于HBV前C区变异是否与拉米夫定耐药相关，各报导显示明显的差异。Tassopoulos等发现，前C区变异株感染的患者发生YMDD变异的频率较高。治疗1年后的YMDD变异率为27%。但Da-Silva等用拉米夫定治疗伴有病毒复制(无论HBeAg阳性或阴性)的慢性乙型肝炎时发现，伴有高病毒载量HBeAg阳性患者易发生HBV变异相关性耐药，而HBeAg阴性的患者，即使其病毒载量很高，也不易发生耐药。
3．HBV亚型对HBV变异的影响。Zollner等研究了26例慢性HBV感染者(13例adw和13例ayw亚型的携带者)用抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎期间HBV对拉米夫定的耐药性与亚型的关系。发现7例adw亚型的携带者和1例ayw亚型的携带者发生了拉米夫定耐药性HBV变异。拉米夫定耐药的危险性adw组比ayw组高20倍。因此认为，adw亚型的HBV与拉米夫定耐药的高危险性相关。Marzano等提出拉米夫定耐药性HBV变异是由HBsAg内部的主要亲水区(major hydrophilic domain, MHD,)决定的。
4．免疫抑制剂治疗对变异的影响。Perrillo等报道肝移植术后接受拉米夫定治疗的肝硬化晚期患者发生YMDD变异者较高。慢性乙型肝炎患者治疗后1年约14%发生变异，肝移植患者治疗1年后约27%发生变异。认为可能与肝移植后应用免疫调节剂治疗，特别是肾上腺皮质激素治疗有可能导致耐药性变异株出现的机会增加。
四．拉米夫定相关性变异的防治
目前关于防治耐药性变异标的发生，许多学者进行的研究，并提出了一些观点，现将有关资料介绍如下。
1．严格掌握临床适应证，选择适当病例治疗。根据近年来的研究结果显示，拉米夫定的疗效与HBV感染者治疗前的ALT相关，治疗前ALT较高者，疗效优于治疗前ALT正常者。因此，拉米夫定临床应用指导意见中认为适合治疗对象是年龄16岁或以上，HBeAg/HBV DNA阳性或HBeAg阴性/抗- HBe阳性/HBV DNA阳性者(前C区变异)者，ALT高于正常，胆红素低于50μmol/L(3.0mg/dL)的慢性乙型肝炎患者。而无症状HBV携带者(尤其是肝活检发现有肝炎证据者)，伴有活动性病毒复制或有肝癌家族史者，偶尔有过肝功能不正常者仅为研究治疗的对象。
2．在治疗过程中监测疗效。按照拉米夫定临床应用指导意见中要求，在拉米夫定治疗开始每2周或每月检测一次肝功能，随改善情况可延长；每3个月检测一次HBeAg、抗-HBe和HBV DNA；每年检测一次HBsAg。一旦发现DNA阳转，ALT升高，则考虑耐药变异株出现的可能。
3．目前认为，耐药发生后可不必立即停药，因其中部分病人继续治疗仍有效，对继续治疗无效的病例可更换其他核苷类药物治疗。在一些研究中证实，当拉米夫定耐药变异株出现后采用阿地福韦(Adefovir)、喷昔洛韦(Penciclovir)，以及其他的核苷类药物仍然有效。
4．改用其他抗病毒药物，如干扰素或其他核苷类药物。目前的数据表明，HBV对拉米夫定与泛昔洛韦有交叉耐药性，因而限制了拉米夫定与泛昔洛韦的联合应用。但我院的1例患者，在服用拉米夫定3年治疗后出现HBV的YMDD变异，乙型肝炎再活动。患者停用拉米夫定后改用泛昔洛韦和干扰素治疗，ALT恢复正常，HBV DNA阴转。Mutimer认为拉米夫定耐药的变异株一般分为两种类型：M550V-L526M和M550I型变异。后者的变异发生被认为与泛昔洛韦无关，因此，变异发生后加用泛昔洛韦仍可达到抑制病毒复制的目的。Fu 等在拉米夫定耐药性HBV对其他核苷类抗病毒药物的敏感性的研究中发现，不同变异型的拉米夫定耐药性HBV对其他核苷类药物的敏感性也不同，对喷昔洛韦、Clevudine和fluorocytidine有交叉耐药性，而阿德福韦对拉米夫定耐药的HBV仍有较强的抑制作用。阿德福韦和恩替卡韦的初步临床研究中显示对HBV的野毒株和拉米夫定耐药株均有效，因此在出现拉米夫定耐药后，选择这些药物，可能达到较好的疗效。Someya等报道了1例61岁男性的慢性乙型肝炎患者，用拉米夫定治疗13个月后出现HBV的YMDD变异。尽管患者继续使用拉米夫定治疗，但在变异后25个月肝病迅速加重。改用α-干扰素治疗后HBV DNA滴度迅速降低，肝病恢复。Ben Ari等的研究证实出现拉米夫定耐药的肝移植者加用麦考酚酸酯抑制HBV复制无效。
5．联合其他抗病毒药物治疗有助于减少耐药变异株的出现。有报道齐多夫定(Zidovudine)与拉米夫定联合治疗艾滋病可产生协同作用。体外实验也证实喷昔洛韦(Penciclovir)与拉米夫定联合对抑制HBV可产生协同作用。因此建议避免耐药性变异株的出现，在治疗中联合应用其他核苷类药物或干扰素。Seehofer等对9例肝移植后耐药性乙型肝炎的再感染的患者进行了回顾性的分析。这些患者在拉米夫定或泛昔洛韦治疗发生耐药后分别采用了拉米夫定与α-2a干扰素或拉米夫定与泛昔洛韦联合治疗，均有效地抑制了HBV的复制。
6．与免疫调节剂联合应用，已有许多学者提出拉米夫定与免疫调节剂联合应用可能提高疗效，减少其耐药的发生。Zhou等曾试图用拉米夫定和腺病毒联合治疗慢性土拨鼠肝炎病毒感染，但对病毒仅产生一过性抑制，作用时间短暂，因此认为这种疗法不能治愈肝炎。
杨湛等以感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的广州麻鸭为实验动物模型，在感染后分别给予口服拉米夫定、肌注麻疹疫苗和联合使用麻疹疫苗加拉米夫定，并以无环鸟苷(ACV)口服作为用药对照组，肌注生理盐水作为病毒对照组。于给药前(T0)，给药第5天(T5)，第10天(T10)及停药第3天(T13)留取血清，采用斑点杂交方法测定DHBV DNA。结果显示拉米夫定组在T5和T13两点病毒量略有下降，但与T0比较，差异均无显著性；麻疹疫苗组在给药早期病毒量无下降，T13点时病毒量与T0比较有显著下降,与病毒对照组的同期比较，差异也有显著性；麻疹疫苗与拉米夫定联合使用组在给药早期(T5)出现病毒量明显下降,停药第3天时的病毒量与给药前及病毒对照组同期比较,差异均有显著性。作者认为:减毒麻疹病毒与拉米夫定联合给药较单独给药对DHBV DNA具有更早而持久的抑制作用。但这些疗法仍处于研究阶段，临床疗效尚待进一步研究。
本文发表于《药物不良反应杂志》2002年