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HBVDNA定量检测临床应用问题与思考

更新时间:2014-10-18 09:25    作者:战胜乙肝网    文章来源:未知 点击次数: 7026
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作者  第二军医大学附属长征医院  赵克开 缪晓辉

HBV DNA检测技术目前已经在临床中普遍应用。但在实际工作中,不少临床医师对如何认识、评价和使用 HBV DNA检测结果仍存在着一些困惑,甚至可能因认识不足、应用不当导致了错误的诊断和治疗。现就 HBV DNA定量检测临床应用的基因诊断和临床治疗研究阐述如下。


一、如何正确认识和评价 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度


任何一种基因检测技术都有一定的灵敏度,即该方法的最低检测限。目前公认的 HBV DNA 定量检测国际“金标准”是罗氏公司生产的 COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM) 实时荧光 PCR HBV DNA 定量检测试剂盒,其血清 HBVDNA 检测灵敏度为 170 拷贝/mL (30 IU/mL)。有学者将雅培公司生产的 HBV DNA 定量检测试剂盒与 CAP-CTM 进行了比较,发现两者灵敏度相似。


目前,国产的 HBV DNA 实时荧光 PCR 定量检测试剂盒灵敏度为 1×103 拷贝/mL,与国外产品尚有一定差距。虽然某些国产试剂盒声称检测灵敏度可达 250 或 300 拷贝/mL,但无充分实验室或临床证据。


有研究显示,将 24 份罗氏公司第一代产品 COBAS Amplicor 试剂盒 HBV DNA 定量在 300-1000 拷贝/mL 的患者血清,分别采用 2 个国产 HBV DNA 试剂盒进行检测,发现后者的漏检例数分别达 11 例 (45.83%) 和 22 例(91.67%)。


与国产试剂盒相比,罗氏公司的 CAP-CTM 检测系统之所以具有较高的灵敏度,除试剂本身的质量及配套的仪器性能等因素外,从技术层面看,尚有其他重要原因:①该检测系统在从血清中分离、提取 HBV DNA 时,采用的是全自动的 HBV DNA 提取系统 COBAS AmpliPrep,且采用的是磁珠吸附柱纯化,尽可能地避免了提取过程中 HBV DNA 的丢失,而国产试剂盒均采用手工提取,且多为煮沸法、Chelex 树脂法等,提取过程中 HBV DNA 丢失较多。有学者研究发现,即使采用同一检测试剂,血清标本的处理方法对 HBV DNA 检测结果也有着直接的影响,煮沸法和 Chelex 树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的 52.78% 和 55.56%。在阳性标本中,同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低 1-2lg拷贝/mL。


②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM 试剂盒用于检测的每份血清量达 650 uL,而国产 HBV DNA 检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为 50-100 uL,但两者提取到的待测 HBV DNA 产物容积一般均为 50 uL。而且,由于反应管体积的限制,进行 PCR 检测时只能再取其中的 2-5 uL 的 HBV DNA 提取产物作为 PCR 检测的模板。


在血清 HBV DNA 含量较低时(1×103拷贝 /mL 以下),在有限的 2-5 uL HBV DNA 提取产物中,能“抓到”多少 HBVDNA 分子进入到 PCR 检测反应管,并被仪器“捕捉”到荧光信号,就存在着一个概率问题:进入检测体系的血清标本量越多,“抓到”足够多的 HBVDNA 分子的概率就越大,荧光仪捕捉到荧光信号的概率也就越高;反之,血清标本量越少,检出概率越低,漏检率也就越高。显而易见,罗氏试剂盒由于增加了进入检测体系的样品容积,其敏感度理论上就比国产试剂盒提高 6-13 倍。


国产 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度偏低可以解释某些临床现象:①CHB 或乙型肝炎肝硬化患者多次检测血清 HBV DNA<1×103拷贝 /mL,在除外合并脂肪肝、药物性肝损害等其他病因后,仍反复出现血清 ALT、AST 升高;


②或在接受抗病毒治疗后,监测血清 HBV DNA 已长时间处于不可测水平以下,但血清 ALT 和 AST 即使加用“降酶药”后仍持续异常。其中的原因可能就是患者体内存在低水平的 HBV 复制,但国产试剂盒却未能检测出。


鉴于我国大多数乙型肝炎患者的经济承受能力有限,没有必要普遍推广使用高灵敏度、高成本的进口试剂盒,因为目前尚无彻底清除 HBV DNA 的药物,即使患者血清 HBV DNA 降到更低的不可测水平,甚至发生血清 HBsAg 转换,但肝脏中仍然会有 HBV DNA 或 HBV cccDNA 存在。


在抗病毒治疗的动态监测过程中,只要患者血清 HBV DNA 持续 <1×103拷贝/mL,结合生物化学、影像学和(或)组织学等指标,就足以对疗效进行恰当的评价。只有在 HBV DNA 水平用国产试剂盒检测 <1×103 拷贝/mL,但①患者未经治疗,ALT 持续异常;②或在抗病毒治疗过程中,出现 ALT 持续不能复常,或复常后又反弹;③或肝脏影像学、组织学有进展;④或有肝硬化、肝细胞癌家族史等高危因素;⑤或 HBV 血清学标志物阴性、但疑有隐匿性乙型肝炎等少数情况下,可以考虑使用高灵敏度的 HBV DNA 检测试剂盒。


二、如何看待 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围


任何检测方法,只有在一定的范围内才有效,即该方法检测的线性范围。检测线性范围包括检测的上限和下限,下限即为检测灵敏度,上限即为其最高检测浓度,待测标本中,如目标分子的浓度低于检测下限可能导致漏检;如高于检测上限,由于高浓度底物的抑制效应,亦有可能导致误检甚至漏检。


影响 HBV DNA 定量检测试剂盒线性范围的因素有:①定量标准品设置的范围。荧光定量 PCR 检测时,一般均采用标准曲线法,只有检测数值位于标准品的定量范围内,结果才是有效的、准确的,不能通过统计公式任意加以外推。部分国产 HBVDNA 定量检测试剂盒说明书上标明检测线性范围为 500-1×108 拷贝/mL,但实际可能只有 1×104、1×105、1×106 和 1×107 拷贝/mL 4 个数量级的标准品,显然是不严谨的。


如待测标本的检测结果低于 1×104 拷贝/mL 或高于 1×10 7 拷贝/mL,均是不可靠的。②检测试剂的质量,如 PCR 引物和荧光探针的保守性、通用性,试剂盒所采用的 Taq 酶的扩增能力、热稳定性,以及反应体系抗干扰系统的设置等,均会直接影响 PCR 的扩增效率和检测线性范围。


HBV DNA 检测试剂盒的线性范围越大,表明其检测效能越高。罗氏、雅培和 Qiagen 公司的 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围分别为 30-1×108 IU/mL、10-1×109 IU/mL 和 20-1×108 IU/mL。根据作者多年的基因实验室和临床工作经验,多数国产试剂盒的线性范围在 1×103-1×108 拷贝/mL,虽检测效能较国外试剂盒小2个数量级,但基本能满足临床需要。


建议对于使用国产试剂盒检测结果为 1×108 拷贝/mL 或以上的血清标本,实验室技术人员可常规对标本进行 1:100-1:1 000 的稀释,然后再次进行检测。这样能确保血清高载量 HBV DNA 的样品检测结果更准确,在抗病毒疗效监测中也能更有效地反映患者实际 HBV DNA 的下降程度。


三、如何看待不同实验室之间 HBV DNA 载量检测结果和单位的差异


常会看到同一患者提供的在同一家医院相近时间段(未经抗病毒治疗),或同期在不同医院(实验室),所测得的 HBV DNA 载量有差异,甚至有很大差异。究其原因,应该包括两个方面:一是检验技术本身固有的“缺陷”,或必然存在的误差;二是试剂、设备和人员技能的差异。


由于 HBV DNA 检测结果是指数形式,且 HBV DNA 本身易发生突变而影响引物和探针的结合,因此不同厂家的 HBV DNA 检测试剂盒之间的检测结果不具有可比性。


在一项研究中,来自美国 9 个独立实验室的学者,对 67 份血清标本分别采用雅培公司的 HBV IUO、罗氏公司的 CAP-CTM 和 HighPure-CTM、Qiagen 公司的 artus HBV TMASR 等 HBV DNA 检测试剂盒进行检测,发现尽管上述试剂盒在检测下限、线性范围、可重复性方面均较好,但①检测结果的中位数以 CAP-CTM 最高,artus HBV TM ASR 最低;②检测结果的可重复性以具有全自动 DNA 提取系统的试剂金较好;③所有试剂盒均有假阳性结果,其中使用手工 DNA 提的试剂盒发生率较高。


鉴于不同方法、不同买验室检测结果之间的差异,欧洲肝病研究会指南特别强调,对治疗过程中 HBV DNA 的随访监测,同一患者需要采取同一种方法。我国有关核苷(酸)类药物耐药预防与管理的专家共识也明确指出,为确保检测结果的稳定性和一致性,对于在同一地方就诊的同一患者,应坚持采取同一种检测方法进行评估。


HBV DNA 定量检测结果以拷贝/mL表述较为直观,易于为临床医师和患者理解。但如采用不同厂家试剂盒进行检测,且结果用拷贝 /mL 表述,其差异较大,不便于比较。


为解决这一问题,由 9 个国家、22 个实验室组成的协作组,对 3 份阳性血清标本采用不同厂家的 HBV DNA 试剂盒进行检测,并将检测结果进行标准化,最后产生一份来自欧洲的“标准血清”(代号 97/746),作为 HBV DNA 核酸扩增检测技术的标准品,定义为 1×106 IU/mL(5×105/反应管),这一标准已被世界卫生组织 (WHO) 所承认。2006 年,该标准血清被一代号为 97/750 的新标准血清取代。


各试剂生产厂家如罗氏、雅培、Qiagen 等,均把待测样品的实测值(拷贝 /mL),用 WHO 的标准血清检测结果进行标化后,赋予标准化值,即 IU/mL。


不同厂家的试剂盒,拷贝/mL 与 IU/mL 的换算系数不同:罗氏公司 CAP-CTM 试剂盒 1 IU/mL=5.82 拷贝/mL,Qiagen 公司的 ReaIArt HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=6 拷贝/mL,西门子 VERSANT HBV DNA 试剂盒 1 IU/mL=5.7 拷贝/mL,雅培公司实时荧光定量 HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=3.41 拷贝/mL。


但为便于临床医师计算,目前国内外相关指南均统一采用 1 IU/mL=5 拷贝/mL进行换算。需要特别指出的是,目前部分国产试剂盒的报告单位“IU/mL”与“拷贝/mL”的实际换算系数是 1,但为了人为地“与国际接轨”,把报告单位标注成“IU/mL”。


四、如何看待与处理 HBV DNA 定量检测结果的假阴性与假阳性


任何检测方法均可能存在假阴性和假阳性。所谓 HBV DNA 定量假阴性是指标本中存在 HBVDNA 却未能检测出来,假阳性是指本来不存在 HBV DNA 却报告检测出阳性结果。


造成 HBV DNA 定量检测假阴性的常见原因有:①HBV DNA 检测试剂盒灵敏度较低,使 HBVDNA 载量较低的标本漏检;②标本采集、运送或保存不当,导致 HBV DNA 被 DNA 酶降解、断裂;③标本中存在抑制 PCR 过程的物质,如肝素抗凝、血脂过高、溶血等;④HBV DNA 发生变异,致使 PCR 检测的引物、探针与 HBV DNA 靶片段不能有效互补结合,不能形成扩增产物或无法产生荧光信号。


作者曾接诊 1 例 HBsAg、HBeAg 阳性 CHB 患者,其未曾进行抗病毒治疗,多次在外院查肝功能均示 ALT 升高,但同时多次查 HBV DNA 均 <1×103 拷贝/mL,并排除合并其他病因,该医院同期其他患者的检测结果亦未发现异常。后该患者在解放军第四 O 四医院复查 HBV DNA 为 5.6×106 拷贝/mL,HBV DNA 测序发现,该患者 HBV DNA 在外院检测时试剂盒所采用的正义 PCR 引物 3’末端存在两个碱基的突变。


造成 HBV DNA 检测假阳性的原因:①标本被污染;②因操作不当或试剂质量等原因导致扩增曲线不平滑、不稳定,在一定热循环数以后扩增曲线出现折线或“翘尾”现象,被系统误检为阳性信号。后者可导致一种令临床医师和患者特别困惑的现象,即已长时间抗病毒治疗的患者,突然检测到低水平的血清 HBV DNA,一般在最低检测限左右,如 (1-2)×103 拷贝/mL,被误以为病毒学反弹或复发,但立即到不同医院或同一医院进行复检,结果 HBVDNA 低于检测下限。对于此种结果,最好的处理办法是进行重复检测。


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